Le travail de nuit correspond à une période de travail d'au moins 9 heures consécutives comprenant l’intervalle entre minuit et 5 heures. Cette période commence au plus tôt à 21 heures et s'achève au plus tard à 7 heures. 

C'est un accord d'entreprise, ou à défaut un accord de branche, qui définit précisément cette période. En l’absence d'accord, le travail de nuit vise le travail accompli entre 21h00 et 6h00, sauf dispositions particulières dans certains secteurs d'activité.

• Le salarié qui accomplit de manière habituelle un travail de nuit au moins deux fois par semaine pendant au moins 3 heures de son temps de travail quotidien.
• Le salarié qui accomplit un nombre minimal d'heures de travail de nuit au cours d’une période de référence. Ce seuil et cette période de référence peuvent être fixés par accord collectif étendu. À défaut d'accord, le travailleur de nuit est celui qui accomplit au moins 270 heures de travail de nuit sur une période de référence de 12 mois consécutifs.

Le travailleur de nuit bénéficie de contreparties sous forme de repos compensateurs et, dans certains cas, de compensations salariales. Ces contreparties doivent être définies par l’accord d'entreprise (ou de branche) permettant le travail de nuit. 

Les travailleurs de nuit obtiennent des points permettant de bénéficier d’une réduction du temps de travail ou d’un départ en retraite anticipé. Ces points sont crédités sur le compte professionnel de prévention (C2P).

Le recours au travail de nuit doit être exceptionnel et justifié. Il doit prendre en compte les impératifs de protection des salariés en matière de santé-sécurité et être justifié par la nécessité d'assurer la continuité de l'activité économique ou des services d'utilité sociale.

L’employeur ne peut pas décider seul d’organiser le travail de nuit. Le recours au travail de nuit doit être négocié avec les délégués syndicaux et faire l’objet d’un accord d’entreprise ou de branche. Le Comité social et économique (CSE) et le médecin du travail doivent également être consultés avant la mise en place du travail de nuit ou toute modification de son organisation. 

L’employeur ne peut pas imposer unilatéralement le travail de nuit, même partiellement. Inversement, l’employeur ne peut pas non plus imposer le travail de jour à un travailleur de nuit. Le refus du salarié ne constitue pas une faute, ni un motif de licenciement.

Les travailleurs de nuit souhaitant occuper ou reprendre un poste de jour sont prioritaires lors de l'attribution d'un poste correspondant à leur catégorie professionnelle ou poste équivalent, au sein de l’entreprise ou de l’établissement. Il en va de même pour les salariés occupant un poste de jour et souhaitant occuper ou reprendre un poste de nuit. L'employeur est tenu de leur communiquer la liste des emplois disponibles.

Par ailleurs, lorsque le travail de nuit est incompatible avec des obligations familiales impérieuses, notamment avec la garde d'un enfant ou la prise en charge d'un proche dépendant, le salarié peut demander un poste de jour. Cela ne constitue ni une faute, ni un motif de licenciement.

Le médecin du travail doit informer les travailleurs de nuit des incidences potentielles du travail de nuit sur la santé. Le salarié bénéficie d'un suivi individuel renforcé, encadré par une visite médicale dont la périodicité ne peut excéder 3 ans.

De façon générale, les contraintes horaires sont plus fortes dans le secteur public, notamment pour les agents qui assurent la permanence des soins ou la sécurité des personnes, comme les infirmiers et les policiers.